細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)操作

細(xì)胞劃痕(wound healing）法是簡(jiǎn)捷測(cè)定細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和修復(fù)能力的方法。

一、原理

在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長(zhǎng)的中央?yún)^(qū)域劃線(xiàn)，去除中央部分的細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的時(shí)間，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在顯微鏡下觀察并拍照記錄特定位置細(xì)胞的生長(zhǎng)遷移能力。

通過(guò)不同分組之間的細(xì)胞對(duì)于劃痕區(qū)修復(fù)能力的不同，可以判斷各組細(xì)胞的遷移與修復(fù)能力的差別。

二、步驟

1、準(zhǔn)備：

所有能滅菌的器械都要滅菌，直尺和 marker 筆在操作前紫外照射 30 min（超凈臺(tái)內(nèi)）

2、流程：

1. 培養(yǎng)板劃線(xiàn)：先用 marker 筆在 6 孔板背后，用直尺比著，均勻得劃?rùn)M線(xiàn)，大約每隔 0.5~1 cm 一道，橫穿過(guò)孔，每孔至少穿過(guò) 5 條線(xiàn)；

2. 鋪細(xì)胞：在孔中加入約 5×105 個(gè)細(xì)胞，具體數(shù)量因細(xì)胞不同而不同，掌握為過(guò)夜能鋪滿(mǎn)；

3. 細(xì)胞劃線(xiàn)：第二天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線(xiàn)劃痕，槍頭要垂直，不能傾斜；

4. 洗細(xì)胞：用 PBS 洗細(xì)胞 3 次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基；

5. 細(xì)胞培養(yǎng)及觀察：放入 37℃、5% CO2 培養(yǎng)箱，培養(yǎng)；按 0，6，12，24 小時(shí)取樣，倒置顯微鏡觀察特定位置細(xì)胞遷移情況并拍照；

6. 結(jié)果分析：使用 Image J 軟件打開(kāi)圖片后，隨機(jī)劃取 6-8 條水平線(xiàn)，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。

三、注意事項(xiàng)

1、鋪細(xì)胞最好使用 6 孔板，因?yàn)?6 孔板可以保證有相當(dāng)距離的平直劃痕，而且因?yàn)橛?5 條定位線(xiàn)，與劃痕相交，這樣就有10 個(gè)可固定監(jiān)測(cè)點(diǎn)，不作重復(fù)，誤差也很小。

2、如果你連續(xù)監(jiān)測(cè) 24 小時(shí)，你需要考慮到劃痕縮小是細(xì)胞遷移和細(xì)胞繁殖共同作用的結(jié)果，而不是單純的細(xì)胞遷移。

如果你要單純的考慮細(xì)胞遷移，你可以先用絲裂霉素（1 ug/ml）處理一小時(shí)，抑制細(xì)胞的分裂，這樣你的結(jié)果就是細(xì)胞遷移的作用了。另外，使用無(wú)血清培養(yǎng)基也可以降低增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 來(lái)測(cè)量劃痕區(qū)域的像素定量比較細(xì)胞遷移的速度。

4、雖然無(wú)血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多。

5、應(yīng)盡量清洗掉散落的細(xì)胞，對(duì)于一些細(xì)胞，低血清濃度下也能重新貼壁并增殖，此外也影響數(shù)據(jù)美觀。

四、常見(jiàn)問(wèn)題

1.劃痕法測(cè)量適用的細(xì)胞范圍較小，一般只適用于上皮細(xì)胞，纖維樣細(xì)胞。

2.雖然無(wú)血清培養(yǎng)可以忽略細(xì)胞增殖的影響，但是由于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)整體性的下調(diào)節(jié)，細(xì)胞遷移的速度也會(huì)慢很多。

3、在用 PBS 緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果。

4、一般做劃痕實(shí)驗(yàn)，需要排除細(xì)胞增殖的影響，一般在不影響細(xì)胞增殖的情況下采用低血清（<2%）或者無(wú)血清，否則細(xì)胞增殖就不能忽略，這樣對(duì)于遷移較慢的細(xì)胞就需要延長(zhǎng)拍攝時(shí)間（也可用絲裂酶處理一小時(shí)）。

5、按照 6 孔板背后畫(huà)線(xiàn)的垂直方向劃痕，可以形成若干交叉點(diǎn)，作為固定的檢測(cè)點(diǎn)，以解決了前后觀察時(shí)位置不固定的問(wèn)題。

6、每次拍照前、后，盡量換掉培養(yǎng)基，去除飄落的細(xì)胞，能得到較為干凈的劃痕區(qū)域。