Transwell侵襲實驗

一、實驗原理

將Transwell小室放入配套培養(yǎng)板中，形成由細(xì)胞可穿透性膜分隔開的兩室系統(tǒng)，并將高營養(yǎng)液與低營養(yǎng)液分隔開，為進(jìn)行侵襲實驗，在膜上室鋪基質(zhì)膠（用由細(xì)胞外基質(zhì)組成的凝膠堵塞膜中的孔，該凝膠旨在模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)侵襲過程中遇到的典型基質(zhì)），通過將細(xì)胞放置在凝膠的一側(cè)，將趨化劑放置在凝膠的另一側(cè)，侵襲細(xì)胞將降解鄰近基質(zhì)并遷移通過ECM凝膠（基質(zhì)降解與定向運動相結(jié)合，即侵襲），從而通過計數(shù)穿過細(xì)胞以檢測細(xì)胞侵襲能力。

由于Matrigel膠內(nèi)含有層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、纖連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、觸角蛋白、TGF2β及生長因子等人體ECM的大多數(shù)成分，類似動物的基底膜。因此，可模擬最真實的體內(nèi)環(huán)境，體外檢測細(xì)胞的侵襲性，間接反映體內(nèi)腫瘤侵襲的能力。

請注意，該結(jié)構(gòu)不是纖維蛋白，而是更偏向凝膠樣

二、實驗步驟

1. 實驗準(zhǔn)備

提前12 h將Matrigel放到4℃融化，將實驗用到的槍頭、EP管等材料提前放到-20℃預(yù)冷；實驗前準(zhǔn)備冰盒，整個實驗操作過程置于冰上進(jìn)行；

2. 包被基底膜

在冰上將Matrigel膠用無血清的細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，混勻后加入小室中，注意動作輕柔，不要產(chǎn)生氣泡，將小室放入CO2培養(yǎng)箱中孵育2h備用；

3. 水化基底膜

將孵育完成的小室中上室多余的液體小心吸掉，每孔中加入100 μL無血清培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中放置30 min。

4. 接種細(xì)胞

a. 將狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行消化，離心，用PBS洗1-2遍，用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1-10×105/ml（需要做預(yù)實驗確定具體的細(xì)胞密度）；

b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培養(yǎng)基，將小室小心放入24孔板內(nèi)，在上室中加入細(xì)胞懸液100 μL-200 μL，放入培養(yǎng)箱中（需要做預(yù)實驗確定具體的培養(yǎng)時間）。

5. 固定染色、拍照及計數(shù)

a. 到時間點后將小室取出，用PBS清洗小室，用棉簽輕柔擦去上室細(xì)胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20 min，將小室適當(dāng)風(fēng)干，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。

b. 將小室置于顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野，拍照并計數(shù)。

三、注意事項

1. Matrigel使用說明

Matrigel應(yīng)避免反復(fù)凍融，分裝時將整瓶Matrigel埋沒在碎冰盒中，再將冰盒置于4℃冰箱中，建議放在冰箱靠后的位置，放置過夜，避免使用冰箱門進(jìn)行解凍，因為其內(nèi)裝物的溫度在反復(fù)打開時會迅速上升，導(dǎo)致材料過早凝膠化。分裝后置于-20℃保存，長期保存可放于-80℃冰箱中；

2. 如何盡量避免增殖對結(jié)果的影響

如果在侵襲實驗期間發(fā)生了大量的增殖，那么計算出的絕對侵襲數(shù)據(jù)將受到影響。因此，侵襲實驗時間越短，增殖對數(shù)據(jù)的影響就越小。當(dāng)然，實驗中的腫瘤細(xì)胞很可能在48或72小時內(nèi)就會增殖，但如果每個治療組的增殖量是相似的，允許直接比較治療組之間的相對侵襲數(shù)據(jù)；

3. 小室的重復(fù)使用

很多實驗室會將小室進(jìn)行重復(fù)利用，我們需要在用棉簽擦拭時避免用力，避免損傷小室膜，重復(fù)利用前應(yīng)在鏡下觀察小室膜是否有裂縫。